提取细菌微量基因组DNA的方法
通过SDS裂解细胞,蛋白酶降解蛋白,CTAB去除多糖成分
一:仪器:赛特湘仪高速冷冻离心机、赛特湘仪台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪
二:试剂:TE、TAE缓冲液;10%SDS;5MNaCL;
20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液(10% CTAB,0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中,缓慢加入10gCTAB,加热溶解);25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇;异丙醇;70%及100%乙醇
三:操作
1.5ml 对数生长期细菌细胞
离心,5000rpm,1min
沉淀
溶于500μl TE缓冲液中混匀
30μl 10%SDS,3μL蛋白酶K,混匀,37℃,1小时
100μl NaCL(5M) 混匀
80μl的CTAB/NaCL,*混匀;65℃ 10min(可不做)
加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,
离心12000rpm,4-5min
取上清,上清液
2V无水乙醇、1/10VnaAC,
-20,2或-80℃,30min
10000RPM,10min
沉 淀
70%冷乙醇洗涤
真空干燥
干粉-20℃保存,
或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20℃或4℃保存
四:鉴定
所提DNA进行Agarose胶分析(电泳过程见附),紫外观测仪观测,凝胶成像系统拍摄。
注意 1,*此步操作后,离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M,否则DNA将与CTAB共沉淀。
2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。
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